La necesidad de un muestreo adecuado es patente cuando cabe la posibilidad de la existencia de gérmenes patógenos o sus tóxinas distribuidas de forma escasa o irregular en un alimento o conjunto de alimentos de un mismo origen.
NÚMERO DE MUESTRAS:
El número de muestras destinadas a un análisis microbiológico esta relacionado con la precisión que se desee obtener los resultados. Este numero se suele fijar cuando se dispone de muchas unidades, sobre todo en forma de lote.
Se suele sugerir que el número de muestras destinadas al análisis corresponda con la raíz cuadrada del número total de unidades constituyentes del lote. También que, teniendo en cuenta el volumen del lote, se tome el 1% del total cuando el lote es grande y el 10% cuando el lote es pequeño.
Estos sistemas son de aplicación a lotes procedentes de industrias cuyo control se desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es suficiente analizar 5-10 muestras de cada lote.
MATERIAL UTILIZADO PARA EL MUESTREO:
Envases para la toma de muestras:
Los envases estarán perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización.
Se pueden utilizar:
- Envases de vidrio boca ancha.
- Envases de plástico esterelizables.
- Bolsas de plástico esterelizables.
- Envases metálicos.
Instrumentos para la apertura de envases:
- Tijeras estériles.
- Pinzas estériles.
- Cuchillos estériles.
- Sondas estériles.
- Taladros estériles.
- Cucharas estériles.
- Espátulas estériles.
- Sierra y otros.
Etiquetas y material para marcar:
- Etiquetas de cartulina.
- Etiquetas adhesivas de papel.
- Lápiz graso.
- Rotuladores.
- Bolígrafos.
Equipos de esterilización:
- Autoclave.
- Horno.
- Mechero, quemador de gas o estufa eléctrica.
Refrigeración:
- Nevera portátil.
- Cajas de plástico aislantes para muestras refrigeradas y congeladas.
- Congelador portátil.
Líquido desinfectante:
- Alcohol etílico al 70%.
- Algodón hidrófilo.
Control de temperatura:
- Termómetro que marque entre -20ºC y + 100ºC.
Esterilización:
El material de toma de muestras para el análisis microbiológico debe ser estéril, es necesario que se haya sometido previamante a esterilización por calor seco o calor húmedo.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA SU ENVIO AL LABORATORIO:
Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada, según su naturaleza, para evitar rotura o deterioro. Los paquetes se etiquetaran y marcaran correctamente, cuidando de que la etiqueta quede bien fijada para evitar que s pierda. La etiqueta irá numerada y adecuadamente identificada para que concuerde con el informe de muestreo que debe acompañar siempre a la muestra representativa. Este informe se identificará con los datos del envase y recopilará todos los datos que puedan ser interesante para el microbiólogo.
- Nombre y dirección de la persona que ha tomado las muestras.
- Nombre y dirección d la persona, empresa.. donde e han tomado las muestras.
- Fecha, lugar y hora en que se han tomado las muestras.
- Clase de alimento que integran las muestras.
- Nombre del fabricante, importador, vendedor, comprador...
- Razón por la cual se ha procedido l muestreo.
- Número, tamaño y marca de las unidades que forman el lote.
- Método de muestreo utilizado.
- Temperatura del producto en el momento del muestreo.
- Temperatura ambiental de almacenamiento.
- Forma de transporte y condiciones de envio de las muestras al laboratorio.
TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS:
El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de muestras y el comienzo del análisis en el laboratorio debe ser lo mas corto posible, para que en los resultados de los análisis quede reflejada, con la mayor fidelidad, la flora que, cualitativa y cuantitativamente, estaba presente en el alimento en l momento del muestreo.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS:
La oparación de preparación de muestras parael análisis microbiológico exige unas reglas de manipulación asépticas muy extrictas, asi como la utilización de material y dilyentes esteriles, con el fin de evitar la contaminación exterior del alimento.
TRITURACIÓN Y HOMOGENIZACIÓN DE ALIMENTOS:
Cuando se trata de alimentos sólidos, es neesario someterlos previamente a una suspensión, utilizando un diluyente esteril.
Toma de muestas para el análisis:
La fracción de alimento destinada al análisis microbiologico debe ser representativa de la totalidad de la muestra. Por lo general, la muetra analítica debe estar constituida, aproximadamente, por 200g de la misma. Para la puesta en marcha de las distintas determinaciones se utilizan 100 g; el resto srve de reserva, por su fuese necesario repetir el análisis.
Para lograr una mayor representatividad, el tamaño de la muestra que se preparará para el analisis será todo lo voluminoso que permita una buena trituración y homogeneización.
La toma de muestra se realizará en condiciones asépticas muy estrictas y con material esteril, utilizando a ser posible, cámara de flujo laminar y en las proximidades de la llama de un mechero.
El material utilizado en la apertura de envases y toma de muestras estará de acuerdo con la naturaleza del producto.
Pesada de la muestra:
Como no es fácil realizar una pesada de la muestra sin evitar una excesiva manipulación, la técnica mas sencilla consite en:
- Tarar el recipiente estéril que vaya a ser utilizado para la trituración.
- Introducir asepticamente, una porción de un volumen adecuado en dicho recipiente.
- Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento.
- Con probeta graduada estéril, añadiremos la cantidad de diluyente para obtener la dilución deseada.
Diluyente:
La característica principal de un buen diluyente es que no produzca modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la flora de los alimentos que van a ser analizados.
Los diluyentes mas utilizados son:
- Agua de triptona con sal (TW)
- Solución de ringer 1/4.
- Agua de peptona tamponada.
El agua de peptona tamponada se suele utilizar en técnicas de investigación de salmonella.
El diluyente que se emplea para la preparación de la suspensión madre suele emplearse, posteriormente, para efectuar diluciones decimales.
Triturado de la muestra:
En este procedimiento hay que evitar la destrucción de los gérmenes por rotura de la membrana o por calentamiento excesivo.
Además de una perfecta trituración también es muy importante obtener una mezcla homogenea para lograr una distribución equilibrada de los gérmenes y sus toxinas.
Existen varios tipos d trituradores pero uno de los mas utilizados es el triturador de paletas (stomacher), que actúa golpeando ritmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha sido previamente introducida en una bolsa estéril. Los choques producidos por las paletas dislaceran el alimento y ponen a las bacterias en suspensión.
PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES:
La preparación de diluciones decimales a partir de una muestra, tiene por objeto efectuar diluciones progresivas para pode realizar recuentos microbianos posteriores.
Material utilizado:
- Triturador homogeneizador.
- Tubos de ensayo.
- Matraces erlenmeyer.
- Pipetas estériles de 10ml y 1ml.
- Agitador excéntrico.
Diluyente (agua de triptona)
Composición:
- Triptona 10g.
- Cloruro Sódico 5g.
- Agua destilada 1000ml.
Preparación:
Mezclamos y disolvemos los ingredientes en el agua. Ajustamos el ph a 7'2. Posteriormente distribuimos en tubos de ensayo 9 ml. Esterilizamos en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Técnica:
Pesamos una porción representativa de la muestra analítica. La cifra de pesada se multiplica por 9 y el resultado dará el volumen de mililitros de diluyente (Tw) que es necesario para obtener la dilución 1:10.
Posteriormente echamos 1ml de la suspensión madre a un tubo que contenga 9 ml de de agua TW. Mezclamos 30 segundos en el agitador excéntrico y de esta manera obtenemos la dilución 1:100. Desechamos pipeta.
De esta dilución cogemos 1 ml y lo vertemos en otro tubo que contenga 9 ml de agua TW. Mezclamos 30 segundos en agitador excéntrico, y así obtenemos dilución 1:1000. Y seguimos así hasta lograr las diluciones deseadas.
De esta forma obtendremos la serie de diluciones seriadas.
Los tubos de la serie se mantendrá en frigorífico hasta el comienzo del análisis, que no deberá demorarse mas de dos horas a partir del momento en que se haya preparado dichas series.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS.
Las enterobacterias se caracterizan por su capacidad de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en un periodo aproximado de 48 horas con una temperatura de incubación de 30-37ºC.
Son bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados.
En el grupo de los coliformes forman parte:
- Echerichia
- Enterobacter
- Citrobacter
- Klebsiella
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales aunque también los podemos encontrar en suelo, plantas, cáscara de huevo...
Dentro de este grupo, los coliformes que tienen más significado sanitario y con lo cual el que más nos interesa en el análisis microbiológico es el coliforme fecal " echerichia coli"
Sus principales características son:
- Se desarrollan ente 43'5-45'5ºC.
- Capacidad de crecer en presencia de sales biliares.
- Facultad de producir indol en agua de peptona.
Por lo general, niveles altos de enterobacterias nos indica manipulación y elaboración deficiente de los alimentos.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS:
Medio líquido:
Para determinar las enterobacterias aprovechamos ciertas características como su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en presencia de sales biliares.
Material:
- Tubos de ensayo.
- Gradilla.
- Pipetas estériles de 10 y 1 ml.
- Estufa de cultivo.
Medio de Cultivo:
Caldo lactosado biliado verde brillante: BGBL
Composición:
- Peptona 10g
- Lactosa 10g
- Bilies de Buey 20g
- Verde brillante 0'0133g
- Agua destilada 1000ml.
Disolver y posteriormente ajustar el pH a 7'4 y distribuir en tubos de ensayo con campana durham de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Técnica:
Preparamos en una gradilla tres series de tres tubos cada una. Cada tubo contendrá 10 ml de BGBL.
En cada uno de los tubos de la primera serie vertemos 1ml de la dilución de la muestra 1:10
En cada tubo de la segunda serie vertemos 1 ml de la dilución de la muestra 1:100
En cada tubo de la tercera serie vertemos 1 ml de la dilución de la muestra 1:1000.
Incubamos las tres series a 31ºC haciendo lecturas a las 24 y 48 horas.
La reacción es POSITIVA cuando se produce desprendimiento de gas en la camapana, por lo menos en 1/10 pate de su volumen, como consecuencia de la fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas.
Con el numero de tubos positivos en cada serie, recurrimos a la tabla del número mas probable (NMP) donde obtendremos el recuento por gramo o mililitro de muestra.
Medio sólido:
En esta técnica se utiliza el medio selectivo agur biliado rojo neutro cristal violeta (VRBA)
Material:
- Placas petri esteriles.
- Pipetas esteriles de 1ml.
- Estufa de cultivo.
- Cuenta colonias.
Medio de cultivo:
Agar biliado-rojo neutro-cristal violeta
Composición:
- Extracto de levadura 3g.
- Peptona 7g.
- Cloruro sódico 5g.
- Sales biliares 10g.
- Lactosa 5g.
- Rojo neutro 0'03g.
- Cristal violeta 0'02g.
- Agar 15g.
- Agua destilada 1000ml.
Disolvemos todos los ingredientes por calentamiento, mantenemos a ebullición dos minutos y ajustamosel ph a 7'4. No esterelizar en autoclave.
Técnica:
A partir de las diluciones decimales y por duplicado, añadimos 1 ml de cada dilución en las placas petri esteriles, a continuación vertemos 15 ml de agar VRBA temperado a 47ºC. Mezclamos cuidadosamente. Una vez solidificado el medio vertemos entre 3-4 ml del mismo medio esteril sobre cada capa , formando una capa que evite el crecimiento excesivo y la extensión de las colonias, ñp que facilitará su recuento. Uncubamos las placas petris en posición invertida a 31ºC durante 24 horas.
La lectura consiste en contar las colonias rojo purpura rodeadas de una sona de precipitación de las sales biliares coor violeta.
Para el recuento se eligen placas que contengan entre 30 y 150 colonias típicas. El número de colonias contadas se multiplica por el factor de dilución de la placa, y como resultado nos da el numero total de enterobacteias totales por gramo o mililitro de muestra.
- PRÓXIMA ENTRADA ANÁLISIS DE PESCADOS FINALIZADA A LO LARGO DE ESTA SEMANA. NO DEJEN DE VISITARME
